Флуоресцирующие метки для ПЦР в реальном времени

Мы уже рассказывали подробнее о ПЦР в реальном времени, пришло время познакомиться поближе с одним из ключевых компонентов метода, появление которого сделало его возможным — флуоресцирующих метках. Они обеспечивают свечение, необходимое для визуализации продуктов реакции. Существует два основных типа меток: интеркалирующие агенты и зонды с флуорофором [1].

В обоих случаях метка выступает в роли репортерной молекулы и флуоресценция, излучаемая ею, возрастает по мере накопления продукта ПЦР, то есть с каждым циклом амплификации.

В зависимости от молекулы, используемой для обнаружения, методы ПЦР в реальном времени можно условно разделить на два раздела:

1. Неспецифическое обнаружение с использованием ДНК-связывающих красителей;
   
2. Специфические зонды для конкретных целей обнаружения.

В первом случае, красители, связывающиеся с ДНК, используются в качестве флуоресцентных репортеров для мониторинга реакции ПЦР в реальном времени. Фиксируя величину излучения на каждом цикле, можно контролировать реакцию ПЦР во время экспоненциальной фазы. Если построить график между логарифмом исходного количества матрицы и соответствующей величиной излучения, то можно отметить линейную зависимость величин.

Один из наиболее широко используемых интераклирующих агентов — SYBR Green, специфичен для двухцепочечной ДНК. Он связывается с малой бороздкой двойной спирали. В растворе несвязанный краситель тоже флуоресцирует, только очень слабо. После связывания с ДНК, флуоресценция возрастает. SYBR Green остается стабильным в условиях ПЦР, в некоторых случаях его модифицируют при помощи оптического фильтра для гармонизации длин волн возбуждения и излучения. Для обнаружения также можно использовать бромид этидия, но его канцерогенность серьезно ограничивает использование.

Интеркалирующие красители достаточно бюджетны и просты в использовании, но у них есть недостаток — флуоресцентный сигнал могут генерировать как специфические, так и неспецифические продукты. Поэтому, в случае необходимости обнаружить конкретную последовательность нуклеотидов внутри ДНК, прибегают к использованию специфичных зондов. Они представляют собой олигонуклеотидные зонды, меченные красителем и тушителем. Во время ПЦР флуорофор и тушитель разделяются, что приводит к увеличению флуоресценции. Разделение происходит либо путем расщепления олигонуклеотида, либо путем изменения вторичной структуры олигонуклеотидного зонда, когда он отжигается с ДНК-мишенью [2,3]. Альтернативный подход к обнаружению и количественному определению нуклеиновых кислот использует фрагменты репортера и тушителя, прикрепленные непосредственно к праймерам ПЦР вместо гибридизационного зонда [4].

Олигонуклеотидные зонды, меченные красителем и тушителем есть нескольких типов [5]:

1. TaqMan. Подобные зонды представляют собой небольшой олигонуклеотид, комплементарный фрагменту ДНК. В его состав входит репортер и гаситель, это два отдельных флуорофора. Когда они расположены рядышком, то гаситель не позволяет зафиксировать свечение репортера. Но при амплификации ДНК-полимераза нарушает целостность зонда и свечение может быть зафиксировано датчиками прибора.
   
   
2. Молекулярные маяки. Они представляют собой одноцепочечные фрагменты ДНК с петелькой, похожей на шпильку. На концах, также, как и в случае TaqMan "сидят" репортер и гаситель. В этом случае флуоресценция считывается прибором уже на этапе отжига праймеров.
   
   
3. Праймеры-скорпионы. По структуре они похожи на маяки, только на после гасителя в довесок еще следует праймер, с которого и начинается амплификация. Флуоресценция считывается на этапе отжига праймера. Только шпилька зонда, подобно хвосту скорпиона соединяется с ДНК, синтезированной с присоединенного праймера.