WGS в метагеномных исследованиях

Зачем секвенировать метагеном?

В клинической микробиологии чаще всего необходимо найти ответ на три вопроса: какие микроорганизмы входят в состав микробиома, что они делают и насколько их функционирование взаимосвязано с жизнью хозяина [1]. В зависимости от того, на какой вопрос необходимо получить ответ, принимаются решения о лабораторных методах для его получения. Достаточно высокий уровень качества имеют диагностические анализы с использованием бактериальной культуры. Выращивание их в агаре позволяет исследовать фенотип конкретных штаммов и чувствительность к антибиотикам [2].

Однако, такой подход требует большого количества времени, а еще есть штаммы, которые трудно вырастить в культуре, что делает их незамеченными при анализе [3]. Также, при работе с культурой мешают сторонние факторы, например, качество агара, возраст культуры, состояние окружающей среды (температура и pH) [4]. Генетические методы анализа призваны преодолеть подобные ограничения и повысить качество получаемых данных.

В 1995 году стал доступен первый полностью секвенированный бактериальный геном — Haemophilus influenzae типа B. После этого секвенирование в области микробной диагностики стало стремительно развиваться. Теперь оно используется в клинической практике для выяснения причины заболевания и в эпидемиологии для контроля инфекций [5].

Для определения и анализа всего генома бактериальной колонии необходимо использоваться полногеномное секвенирование (WGS). Развитие технологии привело к снижению стоимости диагностики.Теперь использовать WGS для клинических исследований и эпидемиологии могут лаборатории с разным объемом ресурсов. Толчком для развития метода в клинической сфере стала пандемия COVID-19, во время которой отсеквенировали несколько миллионов отдельных изолятов коронавируса [6]. За это время возросла осведомленность о контроле качества данных секвенирования и повысилась степень стандартизации аналитических протоколов. Компания Sesana предоставляет полный спектр услуг по полногеномному секвенированию метагенома.

Особенности WGS для работ с микробными сообществами

При анализе патогенов WGS помогает выявить потенциальные риски (такие, как родство штаммов) для обнаружения вспышек, а также определить наличие генов, потенциально кодирующих устойчивость к противомикробным препаратам. В большинстве исследований используется сравнение генома с эталоном. Также прибегают к внутрикластерному картированию с использованием либо основного генома (cg), либо многолокусного типирования последовательности (MLST), сравнения на основе SNP или анализа разделения k-mer (SKA) [7].

При изучении вспышек и путей передачи инфекции используются большие общедоступные наборы данных о геномах для сравнения потенциально родственных штаммов с изолятами, не связанными со вспышками. Например, база данных патогенов на NCBI охватывает набор из 40 видов бактерий и грибов с более чем 1 миллионом доступных геномов.

При секвенировании бактериальных сообществ наиболее часто используемый подход — метагеномика на основе ампликона. Он нацелен на маркерный ген или его фрагмент, за счет чего изучается структура бактериального сообщества. Обычно, полученные последовательности охватывают весь репрезентативный генетический материал образца, включая ДНК хозяина.

Многообещающий новый подход —исследования геномных ассоциаций (GWAS). Метод недавно был переведен из генетики человека в микробиологию. GWAS идентифицирует гены, а также отдельные SNP, обогащенные микроорганизмами и связанные с определенным фенотипом. Примеры включают резистентность к даптомицину у Staphylococcus aureus, связанную с мутациями в участке mprF, и клиническую картину у пациентов, например, разнообразие микроорганизмов в период инфекции мочевыводящих путей [8, 9].

Источники

1. Sharpton T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data //Frontiers in plant science. – 2014. – Т. 5. – С. 209.
   
2. Kuper K. M. et al. Antimicrobial susceptibility testing: a primer for clinicians //Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy. – 2009. – Т. 29. – №. 11. – С. 1326-1343.
   
3. Lagier J. C. et al. The rebirth of culture in microbiology through the example of culturomics to study human gut microbiota //Clinical microbiology reviews. – 2015. – Т. 28. – №. 1. – С. 237-264.
   
4. Corona F., Martinez J. L. Phenotypic resistance to antibiotics //Antibiotics. – 2013. – Т. 2. – №. 2. – С. 237-255.
   
5. Hasman H. et al. Rapid whole-genome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples //Journal of clinical microbiology. – 2014. – Т. 52. – №. 1. – С. 139-146.
   
6. Eyre D. W. Infection prevention and control insights from a decade of pathogen whole-genome sequencing //Journal of Hospital Infection. – 2022. – Т. 122. – С. 180-186.
   
7. Meinel D. M. et al. Outbreak investigation for toxigenic Corynebacterium diphtheriae wound infections in refugees from Northeast Africa and Syria in Switzerland and Germany by whole genome sequencing //Clinical Microbiology and Infection. – 2016. – Т. 22. – №. 12. – С. 1003. e1-1003. e8.
   
8. Biggel M. et al. Horizontally acquired papGII-containing pathogenicity islands underlie the emergence of invasive uropathogenic Escherichia coli lineages //Nature communications. – 2020. – Т. 11. – №. 1. – С. 5968.
   
9. Weber R. E. et al. Corrigendum: Genome-Wide Association Studies for the Detection of Genetic Variants Associated With Daptomycin and Ceftaroline Resistance in Staphylococcus aureus //Frontiers in Microbiology. – 2021. – Т. 12. – С. 686197.